Los dos personajes principales de la serie son Lincoln Burrows (Dominic Purcell) y Michael Scofield (Wentworth Miller). Lincoln es un hombre condenado a morir por un delito que no cometió, acusado de asesinar al hermano de la Vicepresidenta de los Estados Unidos. Michael es su hermano menor. Antes de dedicar todo su tiempo al caso de su hermano, Michael trabajaba como ingeniero estructural en una prestigiosa empresa de Chicago. Michael arriesga su vida para salvar la de su hermano y elabora un plan de escape para librarlo de la ejecución. Michael y Lincoln tienen un amor fraternal tan fuerte, que uno es capaz de sacrificarse para proteger al otro. Lincoln y Michael son los únicos personajes de la serie que han aparecido en todos los episodios de la misma, hasta la fecha.
En la Penitenciaría Estatal Fox River donde Lincoln será ejecutado y donde Michael cumple su condena, hay dos presos importantes en el plan de escape, Fernando Sucre (Amaury Nolasco) y John Abruzzi (Peter Stormare). Sucre es el compañero de celda de Michael en la prisión y fue condenado después de cometer un robo a mano armada, sin embargo, no es un mal hombre y todo lo hizo por amor. Sucre es también el personaje que le da un toque cómico a la trama de la serie, y se va haciendo amigo de Michael para escapar con él de la prisión. Abruzzi es el líder de un grupo de la mafia de Chicago. Es uno de los presos que está también involucrado en el plan de fuga y le hace la vida imposible a Michael los primeros días en la prisión, para que este le entregue a uno de los testigos presenciales de sus crímenes, Otto Fibonacci.
Otros personajes principales en Prison Break son Brad Bellick (Wade Williams) y Sara Tancredi (Sarah Wayne Callies). Bellick es el capitán oficial de la penitenciaría; no le cae bien Michael y siempre es un tropiezo en el plan. Sara es la doctora de la prisión, hija del gobernador del estado de Illinois, Frank Tancredi (John Heard). A Sara al principio sólo le atrae Michael, pero con el tiempo se enamora de él.
Veronica Donovan (Robin Tunney) es amiga de la infancia de Lincoln y Michael. Es abogada y hace hasta lo imposible para apelar el juicio de Lincoln. Su personaje es clave en la primera temporada. L. J. Burrows (Marshall Allman) es el hijo adolescente de Lincoln. Es uno de los más afectados por la sentencia de su padre y se ve forzado a esconderse del Servicio Secreto, pues se convierte en uno de los blancos de la gente que desea la muerte de Lincoln.
Paul Kellerman (Paul Adelstein) es un agente del Servicio Secreto, comete delitos y crímenes trabajando para la Vicepresidenta Caroline Reynolds.
Theodore "T-Bag" Bagwell (Robert Knepper) es el villano de la prisión, un peligroso asesino, entra a ser parte del plan de fuga chantajeando a Michael para incluirlo en su escape. Otro de los convictos de Fox River es Benjamin Miles "C-Note" Franklin (Rockmond Dunbar). Es un padre de familia que está encarcelado por conducir un camión con contrabando ilegal. Sin embargo, sus intenciones nunca fueron malas, ya que lo único que quería era un empleo. Al igual que T-Bag chantajea a Michael para incluirlo en el plan de escape; sin embargo, este no da tantos problemas.
Otros personajes menores de la primera temporada se fueron agregando a lo largo de la misma. Henry Pope (Stacy Keach) es el alcaide de Fox River. Nick Savrinn (Frank Grillo) es un abogado de Proyecto Justicia, colaborador de Verónica Donovan. David "Tweener" Apolskis (Lane Garrison), Charles Westmoreland (Muse Watson) y Charles "Haywire" Patoshik (Silas Weir Mitchell) son los otros reos de importancia de la serie. Nika Volek (Holly Valance), es la esposa de Michael, que ayudó con el plan de escape de Michael y Lincoln. Realmente se casaron para ayudarse uno al otro con favores, dentro y fuera de la prisión.
En la segunda temporada se introduce a la trama un nuevo personaje importante: Alexander Mahone (William Fichtner), agente del FBI que investiga el paradero de Los Ocho de Fox River. Aunque el propósito de Mahone es buscar a los reos que escaparon, a medida que ocurren los hechos La Compañía le obliga a asesinar a todos los convictos, en especial a Michael Scofield. Poco a poco, Mahone va descubriendo las hazañas de Michael y hasta se empareja intelectualmente con él.
Durante la segunda temporada, se fueron agregando otros personajes menores, los cuales ya estuvieron presentes en la primera temporada, pero esta vez tomando papeles más importantes. Terrence Steadman (Jeff Perry y anteriormente John Billingsley) es el hombre supuestamente asesinado por Lincoln. Su hermana Caroline Reynolds (Patricia Wettig) es ahora candidata a la Presidencia de los Estados Unidos.
En la tercera temporada se introducen cuatro nuevos personajes de importancia: Norman "Lechero" St. John (Robert Wisdom) es uno de los mayores capos de la droga en Panamá y es el líder de la Penitenciaría Federal de Sona, después de que esta se haya quedado sin guardias. Gretchen Morgan (Jodi Lyn O'Keefe) es una de las agentes que trabaja para La Compañía. James Whistler (Chris Vance) es uno de los presos de Sona y Sofía Lugo (Danay García) es su novia.
En la cuarta temporada aparecen dos nuevos personajes de importancia, por un lado Donald Self (Michael Rapaport) es un agente especial del departamento de Seguridad Nacional que recluta a los protagonistas para acabar con La Compañía, por el otro bando un nuevo asesino a sueldo de La Compañía: Wyatt (Cress Williams).